Corona-Forschung

März 2021

Die Hauptprotease von SARS-CoV-2 (M^pro) ist essentiell für die Vermehrung des Corona-Virus und stellt ein wichtiges Arzeistoff-Target dar. Ihre Blockade kann die Vermehrung des Virus hemmen. Kleine Arzneistoffmoleküle als Inhibitoren dieser Protease sind daher eine vielversprechende Strategie gegen COVID-19.  Die Arbeitsgruppen von Prof. Christa E. Müller und Prof. Michael Gütschow (beide Pharmazeutische Institut, Pharm. & Med. Chemie) identifizierten geeignete Substrukturen und entwickelten zwei Verbindungsklassen, die die M^pro von SARS-CoV-2 blockieren. Diese rational entworfenen Inhibitoren sind ausichtsreiche Kandidaten für die weitere Entwicklung antivirale Arzneistoffe gegen COVID-19. Oberste Ziel ist es, Arzneistoffe zur Behandlung von COVID-19 zur erhalten. Die Ergebnisse wurden in einer Publikation mit dem Titel: Targeting the Main Protease of SARS-CoV-2: From th Establishment of Hight Throughput Screening to the Design of Tailored Inhibitors. im Journal Angewandte Chemie veröffentlicht.

Mitglieder des Teams vor dem Pharmazeutischen Institut in Bonn v.li.n.re: Miriam Diett, Laura Schäkel, Dr. Vigneshwaran Namasivayam, Katharina Sylvester, Ghazl Al Hamwi, Prof. Dr. Christa E. Müller, Prof. Dr. Michael Gütschow, Julian Breidenbach, Maria Zyulina, Lan Phuong Vu, Carina Lemke © Volker Lannert Uni Bonn

August/ September 2020

Unter dem Dach des Pharma-Zentrums (PZB) forschen fünf Nachwuchswissenschaftler*innen in drei unterschiedlichen Projekten zum neuartigen SARS-CoV-2-Virus bzw. der Covid-19-Pandemie:
Die Nachwuchswissenschaftlerin Marie-Thérèse Hopp (AK Prof. Dr. Diana Imhof, Pharmazeutische Biochemie & Bioanalytik) untersucht in ihrem Projekt die potentielle Rolle des Blutbestandteils Häm bei COVID-19-Infektionen. Ziel ist es, eine bessere Diagnostik und Behandlung bei gleichzeitig vorliegenden oder auftretenden hämolytischen Ergebnissen zu erreichen. Die Nachwuchswissenschaftler Christian Steinebach (AK Prof. Dr. Michael Gütschow, Pharmazeutische & medizinische Chemie), Fabian Baltes und Lukas Gockel (beide AK Prof. Dr. Gerd Bendas, Pharmazeutische & Zellbiologische Chemie) bearbeiten ein Projekt zur Hemmnung der Virusreplikation. Ziel ist es, neuartige chimäre Arzneistoffe zu entwickeln. Diese können möglicherweise in der Lage sein, das Eindringen des neuartigen SARS-CoV-2-Virus in die menschliche Zelle zu bremsen und folglich dessen Replikation zu verhindern. Eine neuartige Technologie in der Arzneistoffentwicklung, nämlich der Einsatz von sog. "Proteolysis Targeting Chimeras" kurz PROTACs, spielt dabei eine zentrale Rolle.
Beide Projekte werden aus Mitteln des Argelander Grants - Sonderausschreibung der Universität Bonn zur Corona-Forschung - für ein Jahr mit 25000 Euro pro Projekt unterstützt (siehe Nachrichten).
Der Nachwuchswissenschaftler Dr. Thanigaimalai Pillaiyar (AK Prof. Dr. Christa  E. Müller) forscht ebenfalls an neuen Wirkstoffen gegen Coronaviren. Seine vielversprechende Forschung setzt an der für die Replikation (Vermehrung) der essentiellen Protease M^pro von SARS-CoV-2-Virus an. Die Wirkstoffe können die Zellmembran überwinden und M^pro sowohl reversibel als auch irreversibel hemmen. Folglich steht das Enzym dem Virus nicht mehr zur Verfügung und die Produktion wichtiger viraler Proteine kommt zum Erliegen. Die Virusreplikation wird gestoppt oder stark verlangsamt. Dr. Pillaiyar entwickelte bereits 2013 einen der potentesten bekannten Inhibitoren gegen M^pro des verwandten SARS-CoV-1-Virus. Erste neue SARS-Co-V-2-Virus M^pro Inhibitoren wurden bereits in In-vitro-Testsystemen charakterisiert und weisen hohe Aktivität auf.

Das PZB sprach mit den Wissenschaftlern*innen
 

PZB: Marie-Thérèse, wie bist Du auf die Idee gekommen, ein solches Projekt zu initiieren?
Marie-Thérèse: Tatsächlich begann alles mit einem im März erschienenen Artikel¹, in dem der Blutbestandteil Häm, auf den sich meine eigne Forschung fokussiert, mit dem Coroanvirus SARS-CoV-2 assoziiert wurde. Dieser Artikel entfachte weltweit hitzige Diskussionen, aber auch in unsere Arbeitsgruppe wurden sowohl die im Artikel beschriebnen angewendeten Methoden als auch die darin vorgestellten Hypothesen kritisch betrachtet. Zugleich häuften sich Studien, die großangelegte Untersuchungen von sich verändernden Blutparametern sowie Symptomen in COVID-19-Patienten präsentierten. Dadurch war der Grundstein dafür gelegt, nach Möglichkeiten zu schauen, wie ich mit der in meiner Promotionszeit erworbenen Expertise und den mir zur Verfügung stehenden Methoden die Forschung an COVID-19 unterstützen kann.
PZB: Was sind die Ausgangspunkte für Deine Forschung? Lassen sich Deine bisherigen Forschungen für Deine Corona-Forschung verwenden?
Marie-Thérèse: Im Rahmen meiner Promotion untersuche ich die regulatorische Funktion von Häm auf Proteine. Unter hämolytischen Bedingungen, wie Sichelzellanämie, Malaria oder bei Bluttransfusionen, wird Häm in einem großen Überschuss freigesetzt. Schutzsysteme des Körpers werden überlastet, sodass anfallendes Häm und seine toxische Wirkung nicht ausreichend abgepuffert werden können. Dadurch kann Häm beispielsweise mit Proteinen, die an wichtigen physiologischen Prozessen wie Entzündung oder Blutgerinnung beteiligt sind, interagieren und so bestimmte Reaktionen des Körpers steuern bzw. beeinflussen. Die Interaktion geschieht durch transiente Bindung an bestimmte Sequenzmotive der Proteine, was häufig eine strukturelle und dann funktionelle Veränderung des Proteins zur Folge hat. Diese Sequenzmotive werden in unserer Arbeitsgruppe bereits seit vielen Jahren intensiv erforscht und charakterisiert, sodass wir auf Grundlage dessen mittlerweile potentiell Häm-bindende Proteine vorhersagen können. Dies wird anschließend über Bindungsstudien und umfangreiche funktionelle Untersuchungen der jeweiligen Proteine in Anwesenheit von Häm weiter untersucht. Und eben dieser Ansatz lässt sich auf andere Zusammenhänge ausweiten. SARS-CoV-2 steuert den Eintritt in den Körper durch ein Zusammenspiel von Oberflächen-exponierten Virus-eigenen Proteinen sowie bestimmten Rezeptoren, die den Wirtszellen eigen sind. Zudem geht man davon aus, dass das Virus später im Blut freigesetzt wird, wodurch ein Zusammentreffen mit Häm sogar potentiell vorstellbar wäre. Daher hatten wir die COVID-19-relevanten Proteine im Vorhinein bereits auf ihr Hämbinde-Potential analysiert, woraus sich einige interessante potentielle Kandidaten ergaben². Außerdem konnten wir in Kooperation mit Prof. Dr. Hofmann-Apitius die wichtigsten Überschneidungspunkte von Häm-induzierten Veränderungen und COVID-19-Infektionen herusarbeiten², was eine wichtige Grundlage des nun gestarteten Projekts darstellt.
PZB: Wie sieht Deine Corona-Forschung aus?
Marie-Thérèse: Wie bereits beschrieben, liegen mir einige Vorarbeiten vor, auf denen das Projekt aufbauen wird. Wichtigstes Ziel hierbei ist, die Vorhersage der potentiell Häm-bindenden beteiligten Proteine mit ersten In-vitro-Experimenten zu überprüfen. Dies wird Bindungsstudien mit Häm sowie die weitere Charakterisierung der Häm-Bindungsmotive auf Peptidebene involvieren. Zeichnen sich auf Grundlage dessen interessante Proteine ab, werden In-silico-Studien und funktionelle Untersuchungen folgen.

PZB: Christian, wie seit ihr, Fabian, Lukas und Du, auf die Idee gekommen, ein solches Projekt zu initiieren?
Christian: Uns alle haben die Bilder aus Italien sehr betroffen gemacht. Bei genauerem Betrachten konnte man feststellen, dass die überwiegende Mehrheit der Patienten, die eine Intensivpflege benötigten, Männer sind. Auch epidemiologische Studien bestätigen diesen Trend¹. Dies könnte auf die männlichen Geschlechtshormone (Androgene) zurückzuführen sein. Interessanterweise reguliert ein Rezeptor, an welchem die Androgene im Körper binden, das Nieveau eines körpereigenen Proteins, das für den Eintritt des Virus benötigt wird. Die Idee ist es, diesen Androgenrezeptor im Körper kurzfristig auszuschalten, um somit das Eintreten von Viruspartikeln in die Zelle zu bremsen.
PZB: Was sind die Ausgangspunkte für eure Forschung, lassen sich eure bisherigen Untersuchungen für eure Corona-Forschung verwenden?
Christian: In den letzten Jahren entstand ein Forschungsschwerpunkt für Protein-Degradation² im Bereich Pharmazeutische & Medizinische Chemie (AK Prof. Dr. Michael Gütschow). Die Techniken, die wir in den letzten Jahren entwickelt haben, lassen sich jetzt sehr leicht auf den Androgenrezeptor übertragen. Zudem wurde von einem amerikanischen Wissenschaftlerteam gezeigt, dass das Auschalten des Androgenrezeptors mittels PROTACs einer herkömmlichen Arzneimitteltherapie überlegen ist. Auch das Protein, welches zum Eintritt des Corona-Virus in die menschliche Zelle benötigt wird, wird dabei massiv unterdrückt. Allerdings waren bisherige Studien mit solchen Arzneistoffen auf die Anwendung bei Prostatakrebs fokussiert.
PZB: Wie kam es zu eurer Zusammenarbeit?
Christian: Unser beiden Arbeitskreise (Ak Prof. Dr. Michael Gütschow und AK Prof. Dr. Gerd Bendas) haben schon vor diesem Corona-Projekt erfolgreich zusammen gearbeitet. Wir kennen uns auch privat sowie aus dem Lehrbetrieb der Universität Bonn und durch das Graduierten-Programm BIGS-DrugS. Da wir "unter einem Dach" forschen und die Wege kurz sind, können wir die unterschiedlichen Expertisen unserer Arbeitskreise sehr gut miteinander kombinieren.
PZB: Was genau sind PROTACs?
Christian: PROTACs (kurz für „Proteolysis Targeting Chimeras“) sind die Hoffnungsträger in der pharmazeutischen Wirkstoffentwicklung. Man macht sich hierbei das körpereigene System zum Abbau ausgedienter Proteine zunutze. Normalerweise ist das ein automatisierter Prozess, der ausgelöst durch bestimmte Signale eingeleitet wird. Hierzu muss das abzubauende Protein von einem Enzym markiert werden, wodurch es in eine Art Protein-Schredder gelangt. Man kann diese Enzyme zur Markierung überflüssiger Proteine auch gezielt adressieren und somit ein beliebiges Protein innerhalb der Zelle ausschalten. Dazu werden zweiarmige chemische Moleküle benötigt, die einerseits an das abzubauende Protein binden, und andererseits die Markierungsenzyme rekrutieren. Solche Arzneistoffe sind sehr aufwendig in ihrer Herstellung, aber äußerst effizient in ihrer Applikation.
PZB: Wie stehen die Chancen für einen klinischen Einsatz Eurer Protein-Killer?
Christian: Der Weg „from bench to bedside” ist immer ein langer Prozess. Wir erleben derzeit jedoch eine Situation, in der händeringend nach einer Lösung für das Corona-Problem gesucht wird. Glücklicherweise gibt es bereits einen Arzneistoffkandidaten, der in klinischen Studien zu Prostata-Krebs untersucht wird. PROTACs könnten also durchaus sichere Medikamente sein. Es gilt jetzt zu zeigen, dass der Androgenrezeptor auch ein attraktives Target für die Behandlung von COVID-19 ist. Auch hier gibt es Hoffnung: Ein schwedisches Team startete kürzlich eine klinische Studie (NCT04475601, „COVIDENZA“) zum kurzzeitigen Einsatz von Wirkstoffen zur Androgenrezeptor-Blockade bei COVID-Patienten.

PZB: Malai, wie bist Du auf die Ideen gekommen, ein solches Projekt zu initiieren?
Malai: Corona-Viren stellen schon seit mehreren Jahren eine Bedrohung für uns Menschen dar^1,2. Aber trotz mittlerweile regelmäßiger Ausbrüche - SARS-1, 2002 und MERS, 2012 - mit teils hohen Sterblichkeitsraten (37 % bei MERS) gab es viel zu wenig Forschung auf dem Gebiet. Das ist der Grund, warum es bis heute noch keine effekiven Arzneimittel gegen Coona-Viren gibt. Wir (AK Prof. Dr. Christa E. Müller) haben schon früh versucht, diesen Mangel zu beheben, indem wir potente Inhibitoren erforschen.
PZB: Inwiefern sind Deine Vorarbeiten, die Synthese des Inhibitors gegen M^pro des verwandten SARS-CoV-1-Virus hilfreich für die Entwicklung eine Wirkstoffs gegen das neuartige SARS-CoV-2-Virus?
Malai: Die Forschungsarbeit an M^pro von SARS-CoV-1-Viren^3-5 war essentiell dafür, dass wir so schnell einen funktionierenden Ansatzpunkt zur Bekämpfung des neuartigen SARS-CoV-2-Virus hatten. Beide Viren sind zwar nicht identisch, aber weisen große Übereinstimmungen in manchen wichtigen Proteinen auf. Im Fall von M^pro ist die Übereinstimmung größer als 96 %. In der Substrat-Bindetasche sogar noch größer. Daher haben wir eine gewisse Wirksamkeit unserer alten Inhibitoren gegen das neue Virus vermutet und freuen uns, dass wir schnell eine neue Leitstruktur identifizieren konnten.
PZB: Wie sieht Deine Forschung aus?
Malai: Zuerst braucht man eine Molekül, welches eine gewisse Affinität  zum gewünschten Enzym hat. Das erreicht man entweder, wie bei uns, durch frühere Forschung, oder heutzutage meistens durch "Hochdurchsatz-Screening" von großen Substanzbiliotheken. Auch das sogenannte "Virtual Screening" am PC wird immer wichtiger. Sehr häufig sehen potentielle Inhibitoen dem eigenen Substart des Enzyms sehr ähnlich und verdrängen es durch ihre höhere Affinität. Das Ziel ist es nun, die Affinität des Inhibitors zu steigern, sodass er noch besser und schneller die Bindetasche blockiert. Dazu werden bestimmte Teile des Moleküle chemisch so verändert, dass sie noch mehr Interaktionen mit dem Enzym eingehen. Es ist aber auch darauf zuachten, dass der Inhibitor z.B. eine gewissen Größe nicht überschreitet, um immer noch durch die Zellmembran zu gelangen.
PZB: Was macht M^pro und was der Inhibitor?
Malai: M^pro ist eine von zwei Proteasen^1,2, die Corona-Viren benötigen, um das Produkt der ersten Translation, ein sehr langes Polyprotein, in kleinere funktionelle und strukturelle Proteine zu zerschneiden. Wenn dieser Schritt unterbleibt, können keine neuen Viruspartikel gebildet werden und die Replikation kommt zum Stillstand. Unsere Inhibitoren haben gewisse Ähnlichkeit mit dem Substrat und werden daher von M^pro als Substrat erkannt. Sie binden sehr gut und vielfach irreversibel, sodass M^pro sie sozusagen nicht mehr loslässt. Das Enzym ist blockiert und kann seine eigentliche Aufgabe nicht mehr wahrnehmen.
PZB:Wie steht es um die Erfolgsaussichten Deines Projekts?
Malai: Wir stehen  noch ganz am Anfang unserer Forschung zu SARS-CoV-2 und es gibt noch viel zu tun. Aber schon jetzt haben wir einige vielversprechende Wirkstoffe entwickelt, die in vorläufigen Tests höhere Aktivität gegen M^pro aufweisen als bisher veröffentlichte Substanzen. Für uns ist es jetzt wichtig, diese Aktivität weiter zu steigern und gleichzeitig auf vorteilhafte physikochemische Eigenschaften, wie Löslichkeit und Bioverfügbarkeit, zu achten. Auch die Selektivität gegenüber körpereigenen Proteasen muss sichergestellt sein, um Nebenwirkungen zu minimieren. Wir arbeiten zusammen mit vielen Forscherteams aus der ganzen Welt und sind zuversichtlich, einen wertvollen Beitrag zur Bekämpfung dieser und zukünftiger Corona-Virus-Pandemien zu leisten.

PZB: Ganz herzlichen Dank an euch alle für diese interessanten und informativen Gespräche. Für eure Forschung wünschen wir euch viel Erfolg!

Die Nachwuchswissenschaftler*innen

Marie-Thérèse Hopp

Kontakt und Informationen zu ihrem Projekt:: Marie-Thérèse Hopp

v.l.n.r: Christian  Steinebach, Lukas Gockel, Fabian Baltes

Kontakt und Informationen zu ihrem Projekt: Christian Steinebach

Dr.Thanigaimalai Pillaiyar

Kontakt und Informationen zu seinem Projekt: Thanigaimalai Pillaiyar

Quellen
 

Marie-Thérèse Hopp:

1 Liu W, Li H. COVID-19: Attacks the 1-beta chain of hemoglobin and capture the porphyrin to inhibit heme metabolism. chemRxiv, 2020

2 Hopp MT, Domingo-Fernández D, Gadiya Y, Detzel MS, Schmalohr BF, Steinbock F, Imhof D, Hofman-Apitius M. Unravelling the debate on heme effects in COVID-19 infections. bioRxiv 2020

Christan Steinebach:

1 Montepoli et al. Androgen-deprivation therapies for prostate cancer and risk of infection by SARS-CoV-2: a population based study (N=4532). Ann.Onc. 2020

2 Steinebach et al: Systematic exploration of different E3 ubiquitin ligase: an approach towards potent and selective CDK6 degraders. Chem.Sci. 2020

Dr.Thanigaimalai Pillaiyar:

1 Pillaiyar T, Sangeetha M, Manickam M. Recent discovery and development of inhibitors targeting human coronaviruses. Drug Disov. Today 2020

2 Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V, Hayashi Y, Jung SH: An overview of severe acute respiratory syndrome-coronavirus (SARS-CoV) §CL protease inhibitors: Peptidomimetics and smal molecule chemotherapy. J.med.Chem. 2016

3 Pillaiyar T, Yamamoto T, Koiwai Y, Yakushiji F, Akaji K, Kawasaki Y, Chen SE, Tavakalian AN, Schön A, Freire E, Hayashi Y. Development of novel dipeptide-type inhibitors with novel P3-scaffolds against SARS-CoV 3CLpro: Design, synthesis, biological evaluation and moelcular docking study. Eur.J.Med.Chem. 2013

4 Pillaiyar T, Yamamoto T, Koiwai Y, Yakushiji F, Akaji K, Kawasaki Y, Chen SE, Tavakalian AN, Schön A, Freire E, Hayashi Y. Design, synthesis, and biological evaluation of dipeptide-type SARS-CoV 3CL protease inhibitors: Structure-activity relationship study. Eur.J.Med.Chem. 2013

5 Pillaiyar T, Yamamoto T, Koiwai Y, Yakushiji F, Akaji K, Kiso Y, Kawasaki Y, Chen SE, Tavakalian AN, Freire E, Hayashi Y. Design, synthesis of new tripeptide-type SARS-CoV 3CL pro Inhibitors containing an electrophilic arycl keton moiety. Bioorg.Med.Chem. 2013